摘要: Klf4在細胞的增殖、分化、凋亡、胚胎的發育、腫瘤的命運決定等過程中發揮重要作用。

    本實驗設計時在klf4目的基因片段前加入了His標簽和TAT標簽，His標簽用來蛋白的分離純化，而TAT標簽則對定向導入靶細胞起著重要作用。與此同時實驗分別設計在大腸桿菌的胞內表達和周質空間表達體系，來探討鼠klf4在大腸桿菌中活性的差別。

    以klf4為模板，分別設計胞內及周質空間表達的引物，克隆出目的基因klf4。目的基因用Nco I 和 Xho I限制性內切酶進行雙酶切，然后分別與用相同限制性內切酶酶切的PET28a及PET20b空載體在T4連接酶作用下連接，再轉入大腸桿菌進行篩選，得到陽性重組子，構建胞內表達載體PET28a-klf4與周質空間表達載體PET20b-klf4。

    成功構建的胞內與周質空間表達載體，轉入大腸桿菌BL21（DE3）菌株，對其表達產物進行鑒定，胞內表達主要以包涵體形式存在。之后上罐高密度發酵并以IPTG誘導表達，并對發酵全蛋白進行SDS-PAGE鑒定及目的蛋白的分離純化。

關鍵詞：Klf4；大腸桿菌；胞內；周質空間；表達；高密度發酵；純化

目錄

摘要

ABSTRACT

第1章 緒論-1

1.1立題背景及依據-1

1.1.1誘導性多能干細胞概述-1

1.1.2 Klf4轉錄因子-1

1.1.3大腸桿菌表達體系-1

1.2 本課題研究的主要內容-2

第2章 Klf4基因的克隆與胞內載體PET28a-Klf4的構建-3

2.1 載體構建說明-3

2.2 實驗材料-3

2.2.1菌株和質粒-3

2.2.2培養基-3

2.2.3主要試劑及工具酶-3

2.2.4主要儀器-4

2.3 實驗方法-5

2.3.1胞內PET28a-Klf4基因的擴增-5

2.3.2 PCR擴增的Klf4基因片段的膠回收-5

2.3.3 PCR擴增膠回收產物Klf4 Xho I/ Nco I雙酶切-6

2.3.4 PCR產物純化-6

2.3.5目的片段Klf4與胞內表達載體PET28a連接-6

2.3.6大腸感受態的制備及轉化-6

2.3.7重組質粒pet28a-klf4的鑒定-7

2.3.8重組質粒測序鑒定-8

2.4實驗結果與討論-8

2.4.1 Klf4基因PCR擴增-8

2.4.2重組質粒PET28a-Klf4的構建-9

2.4.3重組質粒測序結果-10

2.4.4實驗討論-11

第3章 周質空間載體PET20b-Klf4構建-13

3.1 實驗材料-13

3.1.1 菌株和質粒-13

3.1.2 培養基-13

3.1.3 主要試劑及工具酶-13

3.1.4主要儀器-13

3.2實驗方法-13

3.2.1 周質空間PET20b-Klf4載體的構建-13

3.2.2 轉化大腸桿菌感受態-14

3.2.3篩選陽性菌株及重組質粒PET20b-Klf4的鑒定-14

3.3實驗結果-15

3.3.1表達載體PET20b-Klf4的構建-15

3.3.2 重組子菌液PCR驗證.-16

3.3.3雙酶切驗證-16

3.3.4 實驗討論-16

第4章 重組載體的表達與高密度發酵-17

4.1 實驗材料-17

4.1.1 菌株和質粒-17

4.1.2培養基-17

4.1.3試劑-17

4.1.4 實驗儀器-17

4.2實驗方法-18

4.2.1重組菌BL21(DE3)/PET28a-Klf4 , PET20b-Klf4的構建-18

4.2.2 目的蛋白初步鑒定-18

4.2.3重組野生菌Rosetta(DE3)/PET28a-Klf4的高密度發酵表達-19

4.2.4發酵液全蛋白SDS-PAGE電泳鑒定-19

4.3實驗結果-20

4.3.1誘導前后的菌沉淀SDS-PAGE分析-20

4.3.2高密度發酵表達誘導前后產物SDS-PAGE分析鑒定-21

4.3.3實驗討論-22

第5章 目的蛋白的提取及純化-23

5.1 實驗材料-23

5.1.1高密度發酵液-23

5.1.2主要試劑-23

5.1.3 主要儀器-23

5.2 實驗方法-24

5.2.1 蛋白的提取及變性-24

5.2.2 目的蛋白過鎳柱純化-24

5.2.3 目的蛋白疏水柱純化-25

5.2.4 目的蛋白SP柱純化-25

5.2.5純化后蛋白透析復性-25

5.3 實驗結果-26

5.3.1 鎳柱純化SDS-PAGE鑒定-26

5.3.1 疏水柱及SP柱純化-27

5.3.1 梯度鹽離子透析-27

5.4 實驗討論-27

第6章 結論與展望-29

6.1結果-29

6.2不足之處與未來展望-30

參考文獻-31

致  謝-32