摘要:無細胞蛋白表達體系，是一種以細胞提取物為基礎進行體外合成蛋白質表達的技術。與傳統的體內合成蛋白質技術相比，無細胞蛋白質合成（CFPS）技術能夠進行廉價且快速的重組蛋白表達，具有遺傳背景簡單、反應與操作控制簡便等特點。本文利用CFPS技術，在體外合成YycG、YycF蛋白，并用western blot分析檢測蛋白的表達。YycFG（也稱為WalRK，VicRK，MicAB或TCS02）雙組分系統（TCS），是鏈球菌、芽孢桿菌和葡萄球菌等少數低G+C值革蘭氏陽性菌中高度保守的必要雙組分調節系統（essential two-component regulatory system，ETCS）。VicR（YycF）為應答調節蛋白（response regulator protein，RR or RRP），VicK（YycG）為膜相關組氨酸蛋白激酶（histidine protein kinase，HK or HPK）。由于其參與調節細胞壁代謝、調節氧化應激與被膜形成、細胞分裂、調節致病力、滲透壓調節和維護胞膜完整等重要功能中起關鍵作用，該系統異常可導致細菌生活力嚴重下降，甚至死亡，yycF（vicR）非條件突變的細菌一般不能存活，因而成為預防及檢測含有該 ETCS 微生物的首要靶標。

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關鍵詞：細胞提取物；無細胞蛋白質表達系統（CFPS）；YycF(vicR)； VicK（YycG）；western blot

目錄

摘要

ABSTRACT

第一章 文獻綜述-5

1.1引言-5

1.2.1 無細胞蛋白合成技術的發展-5

1.2.2 無細胞蛋白合成技術的原理和優勢-6

1.2.3 影響無細胞體系蛋白合成的因素-8

1.2.4無細胞蛋白表達技術關鍵突破-8

1.3  YycFG雙組分信號轉導系統-9

1.3.1 雙組分調節系統-9

1.3.2 YycFG雙組分信號轉導系統-10

1.4 Western blotting分析-10

1.4.1 Western-blot的原理及優勢-10

1.3.2 影響Western-blot分析結果的因素-11

第二章 實驗材料與方法-13

2.1 實驗材料-13

2.1.1 實驗菌株與質粒-13

2.1.2 主要試劑及規格-13

2.1.3  溶液配制-14

2.1.4實驗儀器與設備-17

2.2  實驗方法-17

2.2.1  大腸桿菌細胞抽提物的制備-17

2.2.2  質粒提取與檢測方法-18

2.2.3  利用無細胞體系合成GFP、yycG、yycF蛋白以及后續檢測-19

2.2.4  GFP、 yycG、YycF蛋白Western blot免疫印跡-21

第三章 實驗結果及討論-23

3.1 重組質粒的檢測-23

3.2 利用無細胞體系合成GFP蛋白的結果檢測-23

3.3  利用無細胞體系合成yycG、yycF蛋白-25

第四章 總結與展望-27

參考文獻-28

附錄I.  pIVEX 2.3d載體圖譜-30

致    謝-31