摘要:目的：克隆宇佐美曲霉羧肽酶基因并將其在畢赤酵母中重組表達，測定重組酶的基本酶學性質(zhì)。方法：以宇佐美曲霉Aspergillus, usamii E001總RNA為模板，通過RT-PCR擴增不含自身信號肽的羧肽酶基因PepF，將其克隆到pUCm-T載體上，經(jīng)PCR和酶切鑒定后進行測序。以重組質(zhì)粒pUCm-T-PepF為模板，通過PCR擴增PepF基因，構建畢赤酵母表達載體pPIC9K-PepF，電轉酵母宿主菌GS115。采用Sephadex G-25 對發(fā)酵液進行初步分離純化，收集活性部分，對重組羧肽酶進行酶學性質(zhì)分析。結果：測序結果表明基因全長1440 bp，編碼含479個氨基酸的成熟肽序列；重組菌在最佳發(fā)酵條件下獲得的表達產(chǎn)物分子量為80,000 Da左右；茚三酮法測得酶活力最高可達57.15 nkat/mg；重組羧肽酶PepF作用的最適溫度為45℃，最適pH為3.5。金屬離子、EDTA等對重組酶的活性影響均較小，而絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對其抑制率達50%以上。結論：在畢赤酵母GS115中成功表達了具有較高酶活的宇佐美曲霉羧肽酶基因并測定其酶學性質(zhì)，為進一步研究該重組酶的應用奠定了基礎。

關鍵詞：宇佐美曲霉；羧肽酶；克隆；表達；酶學性質(zhì)

目錄

摘要

ABSTRACT

第1章 緒論-1

1.1 立題背景-1

1.1.1 目的意義-1

1.1.2 羧肽酶的種類及其特點-1

1.1.3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀-2

1.2 羧肽酶的應用-3

1.2.1 醫(yī)藥工業(yè)應用-3

1.2.2 食品工業(yè)應用-4

1.2.3 蛋白序列測序-4

1.3 羧肽酶研究尚存在的主要問題-4

第2章 實驗材料與方法-5

2.1 實驗材料-5

2.1.1 菌株和質(zhì)粒-5

2.1.2 工具酶-5

2.1.3 實驗試劑-5

2.1.4 細胞培養(yǎng)基配制-5

2.1.5 實驗儀器-6

2.2 實驗方法-6

2.2.1 宇佐美曲霉的誘導培養(yǎng)-6

2.2.2 宇佐美曲霉羧肽酶總RNA的提取-6

2.2.3 茚三酮法測羧肽酶酶活-6

2.2.4 逆轉錄-7

2.2.5 PepF成熟肽基因合成-7

2.2.6 PepF基因與pUCm-T克隆載體的連接-7

2.2.7 JM109感受態(tài)細胞的制備和轉化-8

2.2.8 克隆載體質(zhì)粒pUCm-T-PepF的提取與鑒定-8

2.2.9 pUCm-T-PepF & pPIC9K質(zhì)粒抽提-9

2.2.10 pUCm-T-PepF & pPIC9K EcoRI、NotI雙酶切.-9

2.2.11 pUCm-T-PepF 、pPIC9K連接-9

2.2.12 SacⅠ單酶切pPIC9K-PepF質(zhì)粒-10

2.2.13 線性化pPIC9K-PepF質(zhì)粒回收-10

2.2.14 酵母感受態(tài)的制備-10

2.2.15 電擊轉化-11

2.2.16 轉化子的鑒定與篩選-11

2.2.17 重組菌PCR驗證-11

2.2.18 畢赤酵母中重組PepF的表達-11

2.2.19 搖瓶發(fā)酵條件的初步優(yōu)化-11

2.2.20 重組蛋白的純化-12

2.2.21 重組羧肽酶的酶學性質(zhì)-12

第3章 實驗結果與分析-15

3.1 PepF基因PCR擴增產(chǎn)物的鑒定-15

3.2 EcoR I、Not I雙酶切pUCm-T-PepF-15

3.3 重組表達質(zhì)粒pPIC9K-PepF的構建-15

3.4 重組畢赤酵母GS115/PepF的PCR鑒定-16

3.5 pPIC9K- PepF質(zhì)粒通用引物驗證-16

3.6 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定-17

3.7 搖瓶發(fā)酵條件的初步優(yōu)化-18

3.7.1 標準酪氨酸曲線-18

3.7.2 蛋白濃度標準曲線-18

3.7.3 發(fā)酵條件優(yōu)化結果-18

3.8 重組羧肽酶酶學性質(zhì)研究-19

3.8.1 最適pH值-19

3.8.2 最適溫度-19

3.8.3 PMSF和EDTA對酶活性的影響-19

3.8.4 金屬離子對酶活的影響-20

第4章 結論與展望-21

4.1 結論-21

4.2 不足之處及未來展望-21

參考文獻-23

致  謝-25