摘要：β-半乳糖苷酶簡(jiǎn)稱乳糖酶，細(xì)菌、放線菌、植物、真菌、以及動(dòng)物腸道中廣泛存在。該酶能將一分子乳糖水解為一分子半乳糖和一分子葡萄糖，并能轉(zhuǎn)移半乳糖苷，主要應(yīng)用于治療不耐受乳糖的情況，也可以加工牛乳、乳清，生產(chǎn)低乳糖乳制品。本論文的初衷是從環(huán)境中分離出能分泌乳糖酶的菌株，克隆并獲得乳糖酶基因，為工業(yè)化生產(chǎn)提供材料。

以乳糖為惟一碳源，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)為顯色劑，從土壤中篩選出最高的產(chǎn)β-半乳糖苷酶且生長(zhǎng)較好的菌株。

根據(jù) GenBank 已報(bào)道的β-半乳糖苷酶基因的 DNA序列，利用 PCR 引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的基因組，并將其克隆進(jìn)大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體pGEM-T 中構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T-lacZ，借助 X-gal 顯色在大腸桿菌 DH5a中篩選陽(yáng)性克隆子。得到β-半乳糖苷酶基因，測(cè)得該β-半乳糖苷酶基因全長(zhǎng)1881bp，編碼627個(gè)氨基酸，無(wú)信號(hào)肽序列。

克隆表達(dá)β-半乳糖苷酶，既能夠降解其中的乳糖，克服乳糖不耐癥的問(wèn)題而且不存在食品安全問(wèn)題，并能為后期工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：β-半乳糖苷酶；基因克隆；PCR

目錄

摘要

Abstract

1 緒論-1

1.1 β-半乳糖苷酶的當(dāng)前應(yīng)用現(xiàn)狀-1

1.1.1 β-半乳糖苷酶的自然來(lái)源-1

1.1.2 β-半乳糖苷酶的生理功能-1

1.2 β-半乳糖苷酶的應(yīng)用領(lǐng)域與應(yīng)用前景-2

1.2.1 β-半乳糖苷酶應(yīng)用于食品方面-2

1.2.2 β-半乳糖苷酶應(yīng)用于免疫和檢測(cè)方面-3

1.2.3 β-半乳糖苷酶基因應(yīng)用于基因工程方面-3

1.2.4 β-半乳糖苷酶基因應(yīng)用于基因診斷、治療方面-4

1.3 β-半乳糖苷酶的研究意義-4

1.3.1 選題背景-4

1.3.2 研究意義-5

2 材料與方法-6

2.1 試劑與儀器-6

2.1.1 主要試劑-6

2.1.2 主要儀器-8

2.2常用溶液的配制-9

2.2.1菌種培養(yǎng)基-9

2.2.2 DNA提取所用溶液-9

2.2.3基因的擴(kuò)增及克隆所用試劑-9

2.3 方法-11

2.3.1 菌種篩選-11

2.3.2 菌種鑒定-11

2.3.3 β-半乳糖苷酶基因的克隆-13

3  結(jié)果與討論-18

3.1菌株篩選結(jié)果：-18

3.1.1實(shí)驗(yàn)菌株吸光度值測(cè)得數(shù)據(jù)：-18

3.1.2菌株篩選圖片-18

3.2目標(biāo)乳酸菌基因組DNA的提取-19

3.3引物的設(shè)計(jì)-19

3.4 菌株β-半乳糖苷酶基因的擴(kuò)增-20

3.5 β-半乳糖苷酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收-20

3.5.1擴(kuò)增片段的滯后質(zhì)粒檢測(cè)-21

3.5.2 基因片段滯后質(zhì)粒的酶切鑒定-21

3.5.3滯后質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增檢測(cè)-22

3.5.4 對(duì)經(jīng)過(guò)檢測(cè)的陽(yáng)性克隆作永久性保存-22

結(jié)論-25

致謝-26

參考文獻(xiàn)-27