摘要：彈性蛋白酶(elastase)是一類分解不溶性彈性蛋白的蛋白水解酶，該酶主要存在于動物胰臟中。該酶因其能高度專一水解結締組織中的膠原和彈性硬蛋白，且不破壞其他成分，達到肉類軟化而不失口味的目的，優于目前普遍使用的肉類嫩化劑，在食品加工領域有廣泛的應用前景。

本文以研究假單胞菌彈性蛋白酶為基礎,旨在從微觀水平上了解假單胞菌株的彈性蛋白酶基因。從而為人類大規模生產彈性蛋白酶作出貢獻。

根據已知的彈性蛋白酶基因序列設計彈性蛋白酶基因引物,擴增彈性蛋白酶全長基因,并與pGM-T載體連接,獲得含有Elastase全長基因的重組質粒，進行藍白斑實驗，篩選出白斑，經重組質粒的酶切鑒定與測序分析等方法得出PCR結果為陽性克隆，了解到該編碼基因的片段長度為1494bp,編碼了498個氨基酸,分子量約為53.5kDa。并進行彈性蛋白酶基因在異源宿主細胞中的表達，得知克隆出的彈性蛋白酶基因能夠表達且表達出的彈性蛋白酶具有活性。

關鍵詞： 彈性蛋白酶；基因克??；序列分析

目錄

摘要

Abstract

1 緒論-1

1.1 彈性蛋白酶的研究現狀-1

1.1.1 彈性蛋白酶的分布-1

1.1.2 彈性蛋白酶的分類與來源-1

1.1.3 彈性蛋白酶的功能與結構-1

1.1.4 彈性蛋白酶的酶源激活和催化機理-2

1.1.5 彈性蛋白酶的應用-3

1.1.5.1 彈性蛋白酶在醫藥領域的應用-3

1.1.5.2 彈性蛋白酶在食品、日化工業領域的應用-3

1.2 本實驗的研究目的與意義-4

2 材料與方法-5

2.1 儀器與試劑-5

2.1.1 主要試劑-5

2.1.2 主要儀器-5

2.1.3 引物-6

2.2 實驗方法-6

2.2.1 菌種的保藏-6

2.2.2 基因組的提取-6

2.2.3 彈性蛋白酶基因的PCR擴增及回收-7

2.2.4 目的彈性蛋白酶基因與pGM-T載體的連接過夜

2.2.5 彈性蛋白酶基因的轉化及藍白斑篩選

2.2.5.1 大腸桿菌感受態細胞的轉化

2.2.5.2 用X-gal平板對克隆進行初步篩選

2.2.5.3 轉化子的鑒定

2.2.5.4 將挑選出來的白斑進行重組質粒的酶切鑒定

2.2.5.5 目標質粒的菌落PCR

2.2.6 保種測序

2.2.7 原核表達載體餓構建

3 結果與分析

3.1 基因組的提取及彈性蛋白酶基因的PCR擴增

3.1.1 基因組的提取

3.1.2 彈性蛋白酶基因的PCR擴增

3.2 PCR產物的正確回收

3.3 擴增片段的滯后質粒檢測

3.4 基因片段滯后質粒的酶切鑒定

3.5 滯后質粒的PCR擴增檢測

3.6 彈性蛋白酶基因的測序及分析

3.7 彈性蛋白酶基因在異源宿主細胞中的表達

3.8 彈性蛋白酶活性的表現

結論

致謝

參考文獻

附錄